B16 como un modelo de ratón para el melanoma humano, el melanoma en la cara.

B16 como un modelo de ratón para el melanoma humano, el melanoma en la cara.

20% de los pacientes de melanoma que tenían respuestas objetivas. Ninguno de los pacientes que no respondieron desarrollado vitiligo, ni cualquiera de los más de 100 pacientes que recibieron IL-2 para el tratamiento de cáncer de riñón (Rosenberg y White, 1996).

Modelo de ratón de melanoma subcutáneos

materiales

cultura B16, el 50% de confluencia (véase la ayuda del protocolo 1)

La tripsina / EDTA (Life Technologies)

El medio completo (CM; ver receta), 4C

14. Observe ratones para el crecimiento tumoral. Utilice calibradores para medir diámetros tumorales perpendiculares.

Los tumores en los ratones de control deberían ser palpable en 5 a 10 días; humectación de la piel con etanol al 70% facilita la detección temprana.

INDUCCIÓN DE PROTECCIÓN POR melanoma B16 recombinante de virus vaccinia VACUNA (RVV)

Actualmente, las dos vacunas tumorales que inducen la protección más fiable de los ratones de desafío letal B16 son VVr que codifica la MDA, PGM-1 y se irradió B16 que expresan GM-CSF (Hung et al 1998;. Overwijk et al., 1999). Aunque la inmunización con rVVhgp100 induce altos niveles de CTL-gp100 específica, este régimen es totalmente ineficaz en la prevención de crecimiento de B16 tras la exposición intravenosa o subcutánea. Sin embargo, la transferencia adoptiva de CTL cultivadas, gp100 reactiva in vitro puede reducir en gran medida el número de metástasis pulmonares en el subsiguiente desafío B16 por vía intravenosa (Overwijk et al. 1998).

Las preocupaciones de seguridad respecto al uso de virus recombinantes

materiales

De 6 a 12 semanas de edad C57BL / 6 ratones hembra

3-ml jeringas desechables y 27 1/2-G agujas

preparar CTL

CTL 1. Cosecha B16-específicos que se volvieron a estimular la última hace 5 días pipeteando arriba y abajo de los pozos y traslado al tubo de centrífuga cónico de 50 ml.

Uno bien confluente de una placa de 24 pocillos produce normalmente 5 10 5 2 10 6 a la CTL.

2. Pellet CTL 10 min a 663 gramo (En un rotor Sorvall H-2000B a 1500 rpm), 4C. Resuspender CTL en HBSS enfriado con hielo, con el objetivo para una concentración final de 2 10 7 células / ml.

Si un montón de escombros está presente en las culturas, purificar CTL en un gradiente de Ficoll de acuerdo con el protocolo del fabricante (véase la ayuda del protocolo 3).

Restos causará embolias letales tras la inyección intravenosa.

3. Contador de CTL utilizando azul de tripano para excluir las células muertas ( 3b del apéndice ).

4. Diluir CTL a desear concentración, teniendo en cuenta que cada ratón es recibir 0,5 ml de suspensión de CTL. Mantener en hielo.

transferir CTL

7. Resuspender CTL antes de la inyección invirtiendo varias veces tubo. Inyectar 0,5 ml CTL suspensión por vía intravenosa en la vena de la cola usando una jeringa de 3 ml y una aguja 27-G.

Cuando la inyección de grandes números de células (es decir, 5 10 6), inyectar lentamente para evitar embolias.

Opcional: inyectar 60.000 a 600.000 UI rhIL-2 en 0,5 ml de PBS por vía intravenosa dos o tres veces al día durante 5 días o hasta que los ratones muestran signos de toxicidad (pelo erizado, postura encorvada).

Sacrificio y evaluar la carga tumoral pulmonar

8. La eutanasia a los ratones por CO2 la asfixia de 16 a 18 días después de la inoculación del tumor y enumerar las metástasis pulmonares (véase la ayuda del protocolo 2). Alternativamente, siga los ratones para la supervivencia.

los ratones no tratados comenzarán a morir de la congestión pulmonar tumoral comenzando alrededor del día 21.

CULTIVO melanoma B16

NOTA: Todas las soluciones se preparan usando agua doblemente destilada o filtrada Milli-Q-(Millipore) y se filtró de forma estéril a través de 0,2-um unidades de filtro (Nalgene). Todas las incubaciones de cultivo se realizan en un 37C humidificado, 5% de CO2 incubadora.

materiales

criopreservados vial de B16.F10

El medio completo (CM; ver receta), enfriada con hielo

Almacenar hasta 1 año, 4C

COMENTARIO

Antecedentes

B16 como un modelo para el melanoma humano: semejanzas y diferencias

melanoma B16 es una de las muy pocas líneas de melanoma pigmentadas disponibles para su uso en ratones, aunque los modelos recientemente transgénicas se han desarrollado en el que la incidencia fiable de melanoma permite el establecimiento de nuevas líneas (Chin et al 1997;. Otsuka et al., 1998; Zhu et al., 1998). Además, un informe reciente describió un retrovirus derivado de B16 en sí que puede transformar, melanocitos de ratón en cultivo normales para establecer líneas tumorales de melanoma que crecen en ratones normales, inmunocompetente (Li et al. 1998). Curiosamente, estas líneas de células tumorales, como B16, expresan niveles bajos de MHC de clase I en comparación con otros C57BL / 6 tumores derivados tales como los sarcomas inducidos por metilcolantreno (serie MCA) y otras células comúnmente usadas tales como EL-4 timoma o esplenocitos normales . Esta baja expresión de MHC de clase I parece ser una característica de las normales C57BL / 6 melanocitos de ratón que se conserva después de la transformación con el melanoma (Li et al 1998;.. E. Gorelik, comunicación personal.).

Cómo inducir respuestas inmunes: vacunas eficaces

En el laboratorio de los autores, los tres siguientes protocolos de tratamiento fiable y reproducible tienen un impacto significativo sobre el crecimiento B16.

Protección contra el desafío B16 subcutánea de ratones con despigmentación autoinmune (es decir, vitiligo) después de dos vacunaciones con virus vaccinia recombinante (RVV) que codifica ratón TRP-1 (rVVmTRP-1; Overwijk et al., 1999).

¿Cómo definir el tipo de respuesta inducida

Las discrepancias entre los resultados de in vivo e in vitro

Parámetros críticos

El recuento de las metástasis pulmonares, la medición de los tumores subcutáneos, y la puntuación de vitiligo son altamente susceptibles a sesgo del observador y deben ser realizadas de una manera ciega.

Solución de problemas

Para obtener instrucciones detalladas sobre cómo solucionar problemas, por favor vaya a la Tabla 20.1.3 de directrices.

Guía de solución de problemas para el Uso del modelo de ratón para Melanoma Humano

Consideraciones de tiempo

En experimentos in vivo requieren una planificación cuidadosa, ya que pueden tardar varias horas de trabajo ininterrumpido con el fin de reducir al mínimo las células tumorales de tiempo o CTL permanecen en hielo. Un experimento típico de tratamiento de metástasis pulmonar dura 16 a 18 días desde el día de la inoculación del tumor. cantidades suficientes de células tumorales y CTL deben estar listos para su uso en los días apropiados (por lo general el día 3 después de la inoculación del tumor); Además de la transferencia adoptiva de CTL se debe utilizar entre 5 y 10 días después de la última re-estimulación. tumores subcutáneos se pueden dejaron crecer durante 2 a 3 semanas antes de los ratones deben ser sacrificados debido a la gran carga tumoral. Para inducir vitiligo, dos inyecciones de rVVmTRP-1 están espaciados al menos 2 semanas aparte, sobre la cual se toma otro 2 a 3 semanas hasta que los ratones desarrollan vitiligo detectable y están protegidos de B16 toma tumor. Esperar más tiempo después de la aparición de vitiligo antes de desafiar provoca la respuesta inmune a disminuir, y la protección contra el crecimiento de B16 será menos completa.

Literatura citada

  • Bloom MB, Perry-D Lalley, Robbins PF, Li Y, el-Gamil H, Rosenberg SA, Yang JC. Identificación de la proteína relacionada con la tirosinasa-2 como un antígeno de rechazo de tumores para el melanoma B16. J. Exp. Medicina. 1997; 185: 453-459. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Bohm W, S Thoma, Leithauser M, P Moller, Schirmbeck R, Reimann J. T cellmediated, IFN-gamma-facilitado el rechazo de los melanomas B16 murino. J. Immunol. 1998; 161: 897-908. [PubMed]
  • Brichard VG, Herman J, Van Pel A, C Wildmann, Gaugler B, Wolfel T, T Boon, Lethe B. Un nonapéptido tirosinasa presentado por HLA-B44 se reconoce en un melanoma humano por citolíticos autólogo linfocitos T. EUR. J. Immunol. 1996; 26: 224-230. [PubMed]
  • Bronte V, E Apolloni, Ronca R, P Zamboni, Overwijk WW, Surman DR, Restifo NP, la vacunación genética Zanovello P. con la auto proteína relacionada con tirosinasa-2 hace que la erradicación de melanoma, pero no vitíligo. Cancer Res. 2000; 60: 253-258. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades calcularon la incidencia del melanoma maligno en 1999. 1999. (genérico) Ref Tipo: http://www.cdc.gov/cancer/nscpep/skin99.htm de comunicaciones de Internet.
  • Chen L, P McGowan, Ashe S, Johnston J, Li Y, Hellstrom I, Hellstrom KE. inmunogenicidad del tumor determina el efecto de la coestimulación B7 en T inmunidad tumoral cellmediated. J. Exp. Medicina. 1994; 179: 523-532. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Chin L, J Pomerantz, Polsky D, M Jacobson, Cohen C, Cordón-Cardo C, Horner JW, DePinho RA. efectos cooperativos de INK4a y ras en la susceptibilidad de melanoma in vivo. Genes Dev. 1997; 11: 2822-2834. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Colella TA, TN Bullock, Russell LB, Mullins DW, WW Overwijk, Luckey CJ, Pierce RA, Restifo NP, Engelhard VH. Auto-tolerancia al homólogo murino de un antígeno de melanoma de la tirosinasa derivados. Implicaciones para la inmunoterapia tumoral. J. Exp. Medicina. 2000; 191: 1221-1232. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Cox AL, Skipper J, Chen Y, Henderson RA, Darrow TL, Shabanowitz J, Engelhard VH, Hunt DF, Slingluff CLJ. Identificación de un péptido reconocido por cinco líneas de células T citotóxicos humanos específicos de melanoma. Ciencia. 1994; 264: 716-719. [PubMed]
  • Donawho CK, Muller HK, Bucana CD, Kripke ML. crecimiento mejorado de melanoma murino en la piel ultravioleta irradiados se asocia con la inhibición local de la mecanismos efectores inmunes. J. Immunol. 1996; 157: 781-786. [PubMed]
  • Dranoff G, E Jaffee, Lazenby A, Golumbek P, H Levitsky, Brose K, Jackson V, Hamada H, Pardoll D, Mulligan RC. La vacunación con células tumorales irradiadas por ingeniería genética para secretar el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos murino estimula potente, específico, y de larga duración de inmunidad anti-tumor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 3.539-3.543. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Dyall R, Bowne WB, Weber LW, LeMaoult J, P Szabo, Moroi Y, Piskun G, Lewis JJ, Houghton AN, Nikolic-Zugic J. heteróclita de inmunización induce inmunidad tumoral. J. Exp. Medicina. 1998; 188: 1553-1561. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Earl PL, Cooper N, L Wyatt, Moss B, Carrol M. Preparación de cultivos celulares y las reservas de virus vaccinia. En: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, editores. Protocolos actuales en biología molecular. John Wiley and Sons; Nueva York: 1998. pp 16.16.1-16.16.19..
  • Fidler IJ, Bucana C. Mecanismo de resistencia de las células tumorales a la lisis por los linfocitos singénicos. Cancer Res. 1977; 37: 3945 hasta 3956. [PubMed]
  • Fidler IJ, Gersten DM, Budmen MB. Caracterización in vivo e in vitro de las células tumorales seleccionadas para la resistencia a singénico citotoxicidad mediada por linfocitos. Cancer Res. 1976; 36: 3.160-3.165. [PubMed]
  • Hara I, Takechi Y, Houghton AN. Que implican un papel para el reconocimiento inmune de sí mismo en el rechazo del tumor: La inmunización pasiva contra la proteína locus marrón. J. Exp. Medicina. 1995; 182: 1609-1614. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Hart IR. La selección y caracterización de una variante invasivo del melanoma B16. A.m. J. Pathol. 1979; 97: 587-600. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Hung K, Hayashi R, Lafond-Walker A, Lowenstein C, Pardoll D, Levitsky H. El papel central de las células CD4 (+) las células T en la respuesta inmune antitumoral. J. Exp. Medicina. 1998; 188: 2357-2368. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Irvine KR, Chamberlain RS, Shulman EP, Surman DR, Rosenberg SA, Restifo NP. Mejorar la eficacia de las vacunas contra el cáncer recombinantes con regímenes de inducción / potenciación que utilizan dos vectores diferentes. J. Natl. Cancer Inst. 1997; 89: 1595-1601. [PubMed]
  • Kameyama K, C Sakai, kuge S, S Nishiyama, Tomita Y, Ito S, K Wakamatsu, VJ audición. La expresión de la tirosinasa, proteínas relacionadas con la tirosinasa 1 y 2 (TRP1 y TRP2), la proteína de plata, y un inhibidor de melanogénica en células de melanoma humano de diferentes actividades melanógenas. Pigment Cell Res. 1995; 8: 97-104. [PubMed]
  • Kang X, Y Kawakami, el-Gamil M, Wang R, Sakaguchi K, Yannelli JR, Appella E, Rosenberg SA, Robbins PF. Identificación de un epítopo de la tirosinasa reconocido por HLA-A24-restringido, linfocitos infiltrantes de tumor. J. Immunol. 1995; 155: 1343-1348. [PubMed]
  • Kawakami Y, Eliyahu S, Sakaguchi K, Robbins PF, Rivoltini L, Yannelli JR, Appella E, Rosenberg SA. Identificación de los péptidos inmunodominantes del antígeno de melanoma humano MART-1 reconocido por la mayoría de los linfocitos infiltrantes de tumores restringidos por HLA-A2. J. Exp. Medicina. 1994; 180: 347-352. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Kawakami Y, Eliyahu S, Jennings C, Sakaguchi K, Kang X, Southwood S, Robbins PF, Sette A, Appella E, Rosenberg SA. El reconocimiento de múltiples epítopos en el antígeno gp100 de melanoma humano por los linfocitos T infiltrantes de tumores asociados con la regresión del tumor in vivo. J. Immunol. 1995; 154: 3.961 a 3968. [PubMed]
  • Kawakami Y, Robbins PF, Wang X, Tupesis JP, Parkhurst MR, Kang X, Sakaguchi K, Appella E, Rosenberg SA. Identificación de nuevos epítopos de melanoma en proteínas melanosomal reconocidos por linfocitos T infiltrantes de tumores restringidos por HLA-A1, – A2, y -A3 alelos. J. Immunol. 1998; 161: 6.985-6.992. [PubMed]
  • Kittlesen DJ, Thompson LW, Gulden PH, Skipper JC, Colella TA, Shabanowitz JA, Hunt DF, Engelhard VH, Slingluff CLJ. los pacientes con melanoma humanos reconocen un epítopo CTL restringidos por HLA-A1 de la tirosinasa que contiene dos residuos de cisteína: Implicaciones para el desarrollo de vacunas tumorales. J. Immunol. 1998; 160: 2099-2106. [PubMed]
  • Li M, Xu F, J Muller, VJ audición, Gorelik E. Ecotropic de tipo C de retrovirus del melanoma B16 y la transformación maligna de los melanocitos normales. Int. J. Cancer. 1998; 76: 430-436. [PubMed]
  • Naftzger C, Takechi Y, Kohda H, I Hara, Vijayasaradhi S, Houghton AN. La respuesta inmune a un antígeno de diferenciación inducida por el antígeno alterada: Un estudio de rechazo del tumor y la autoinmunidad. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: desde 14.809 hasta 14.814. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Otsuka T, H Takayama, Sharp R, G Celli, LaRochelle WJ, Bottaro DP, Ellmore N, W Vieira, Owens JW, Anver M, Merlino G. c-Met activación autocrina induce el desarrollo del melanoma maligno y la adquisición del fenotipo metastásico. Cancer Res. 1998; 58: 5.157 a 5.167. [PubMed]
  • Overwijk WW, Surman DR, Tsung K, Restifo NP. La identificación de un epítopo CTL restringido por Kb de la beta-galactosidasa: uso potencial en el desarrollo de protocolos de inmunización para los antígenos propios. Métodos. 1997; 12: 117-123. [PubMed]
  • Overwijk WW, Tsung A, Irvine KR, Parkhurst MR, Goletz TJ, Tsung K, Carroll MW, Liu C, Moss B, SA Rosenberg, Restifo NP. gp100 / pmel 17 es un antígeno de rechazo de tumores murinos: inducción de células auto-reactivos, tumoricida T usando alta afinidad, alterado ligando peptídico. J. Exp. Medicina. 1998; 188: 277-286. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Overwijk WW, Lee DS, Surman DR, Irvine KR, Touloukian CE, CC Chan, Carroll MW, Moss B, SA Rosenberg, Restifo NP. La vacunación con un virus vaccinia recombinante que codifica un antígeno propio induce la destrucción de células tumorales vitiligo y autoinmune en ratones: obligación de linfocitos CD4 (+) T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 2982-2987. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Parkhurst MR, Fitzgerald EB, Southwood S, Sette A, Rosenberg SA, Kawakami Y. Identificación de un compartido HLA-A * 0201-restringido epítopo de células T de la proteína relacionada con la tirosinasa-antígeno de melanoma 2 (TRP2) Cancer Res. 1998; 58: 4895 a 4901. [PubMed]
  • Robbins PF, el-Gamil H, Li YF, Fitzgerald EB, Kawakami Y, Rosenberg SA. La región intrónica de un transcrito de gen de gp100 incompletamente empalmado codifica un epítopo reconocido por los linfocitos infiltrantes de tumor de melanoma reactiva. J. Immunol. 1997; 159: 303-308. [PubMed]
  • Rosenberg SA. Vacunas contra el cáncer basadas en la identificación de genes que codifican antígenos de regresión del cáncer. Immunol. Hoy. 1997; 18: 175-182. [PubMed]
  • Rosenberg SA. Una nueva era para la inmunoterapia del cáncer basado en los genes que codifican los antígenos del cáncer. Inmunidad. 1999; 10: 281-287. [PubMed]
  • Rosenberg SA, White DE. El vitíligo en pacientes con melanoma: normal de antígenos de tejido puede ser dianas para la inmunoterapia del cáncer. J. Immunother. Énfasis. Immunol tumor. 1996; 19: 81-84. [PubMed]
  • Schneider J, Brichard V, Boon T, Meyer z.B.K. Wolfel T. La superposición de péptidos de antígeno de diferenciación de melanocitos MelanA / MART-1 reconocido por citolíticos autólogo linfocitos T en asociación con HLA-B45.1 y HLA-A2.1. Int. J. Cancer. 1998; 75: 451-458. [PubMed]
  • Skipper JC, Kittlesen DJ, Hendrickson RC, DD Deacon, Harthun NL, Wagner SN, Hunt DF, Engelhard VH, Slingluff CLJ. epítopos compartidos para restringidos por HLA-A3 CTL humana melanoma reactiva incluyen un epítopo procesado naturalmente de PmeI-17 / gp100. J. Immunol. 1996; 157: 5.027-5.033. [PubMed]
  • Topalian SL, MI Gonzales, Parkhurst H, Li YF, Southwood S, Sette A, Rosenberg SA, Robbins PF. células T CD4 + específicos de melanoma reconocen epítopos tirosinasa restringidos por HLA-DR no mutadas. J. Exp. Medicina. 1996; 183: 1965-1971. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Touloukian CE, Leitner WW, Topalian SL, Li YF, Robbins PF, Rosenberg SA, Restifo NP. La identificación de un epítopo de gp100 humana MHC de clase II restringido el uso de ratones transgénicos DR4-IE. J. Immunol. 2000; 164: 3535 hasta 3542. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Tsai V, Southwood S, Sidney J, Sakaguchi K, Kawakami Y, Appella E, Sette A, Celis E. Identificación de epítopos de CTL subdominante de la GP100 melanoma- antígeno asociado a tumor por inmunización primaria in vitro con células dendríticas pulsadas con péptido-. J. Immunol. 1997; 158: 1796-1802. [PubMed]
  • Van Elsas A, Hurwitz AA, Allison JP. inmunoterapia de combinación del melanoma B16 usando anti-linfocitos T citotóxicos antígeno asociado 4 (CTLA-4) y de granulocitos / macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF) vacunas -producir induce rechazo de tumores subcutáneos y metastásicos acompañados de despigmentación autoinmune. J. Exp. Medicina. 1999; 190: 355-366. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Wang RF, Appella E, Kawakami Y, Kang X, Rosenberg SA. Identificación de TRP-2 como un antígeno de tumor humano reconocido por linfocitos T citotóxicos. J. Exp. Medicina. 1996a; 184: 2207-2216. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Wang RF, Parkhurst MR, Kawakami Y, Robbins PF, Rosenberg SA. La utilización de un marco de lectura abierto alternativo de un gen normal en la generación de un nuevo antígeno de cáncer humano. J. Exp. Medicina. 1996b; 183: 1131-1140. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Weber LW, Bowne WB, Wolchok JD, Srinivasan R, Qin J, Moroi Y, Clynes R, Song P, Lewis JJ, Houghton AN. inmunidad tumoral y autoinmunidad inducida por la inmunización con ADN homólogo. J. Clin. Invertir. 1998; 102: 1258-1264. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Un Winder, Kobayashi T, Tsukamoto K, Urabe K, P Aroca, Kameyama K, VJ audición. Los familyinteractions gen de la tirosinasa de proteínas melanógenas para regular la melanogénesis. Cell Mol. Biol. Res. 1994; 40: 613-626. [PubMed]
  • Wolfel T, Van Pel A, Brichard V, J Schneider, Seliger B, Meyer z.B.K. Boon T. Dos nonapéptidos tirosinasa reconocidos en los melanomas HLA-A2 por los linfocitos T citolíticos autólogos. EUR. J. Immunol. 1994; 24: 759-764. [PubMed]
  • Wu TC, Huang AY, Jaffee EM, Levitsky HI, Pardoll DM. Una reevaluación del papel de la expresión de B7-1 en el rechazo del tumor. J. Exp. Medicina. 1995; 182: 1415-1421. [PMC libres artículo] [PubMed]
  • Zeh HJ, Perry-D Lalley, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC. CTL de alta avidez para dos antígenos propios demuestran superior en vitro y la eficacia antitumoral in vivo. J. Immunol. 1999; 162: 989-994. [PubMed]
  • Zhu H, Reuhl K, Zhang X, Botha R, Ryan K, Wei J, Chen S. El desarrollo de melanoma hereditario en ratones transgénicos. J. Invest. Dermatol. 1998; 110: 247-252. [PubMed]

PUESTOS RELACIONADOS

También te podría gustar...